樣品制備不當是否正在影響您的生物分析方法?

引言

樣品制備在使用色譜法進行生物分析中至關重要。如果不進行任何樣品制備步驟，例如蛋白沉淀、磷脂去除 (PLR)、液液萃取 (LLE) 或固相萃取 (SPE)，系統性能將受到負面影響。常見的問題包括高效液相色譜 (HPLC) 管路堵塞、色譜柱污染、質譜儀源污染以及靈敏度下降。

樣品制備方法的清潔性能各不相同，其中蛋白沉淀是用于色譜分析生物樣品（如血漿或血清）流行的方法之一。這是一種快速且簡單的操作 - 將樣品加入溶劑后引發蛋白沉淀，最終通過過濾器過濾液體，獲得無蛋白的樣品。

盡管蛋白沉淀可以去除蛋白，但它無法去除其他基質成分，例如磷脂。這些基質成分在進行 LC-MS/MS 分析時會引發以下問題：

1. 磷脂會影響質譜儀源中的離子化，通常表現為離子抑制，更少見的是離子增強，從而降低分析的穩健性。^[1]

2. 磷脂會污染質譜儀源，導致維護成本增加，同時儀器停機時間也會延長。

3. 磷脂會在 HPLC 柱上積累，隨著時間的推移導致柱背壓升高并縮短柱的使用壽命。^[2]

樣品制備的改進技術

磷脂去除（PLR）是一種用于生物樣本分析的樣本制備技術。PLR與蛋白沉淀板的操作流程相似，但其產品中加入了一種活性成分，可以捕獲磷脂而不保留目標分析物（如圖1所示）。因此，PLR為生物樣本制備提供了全面的解決方案。

圖1 - 用于制備用于LC-MS分析的血漿的簡單PLR。

在本應用說明中，比較了兩種常用樣品制備方法（磷脂去除PLR和蛋白沉淀）在LC-MS/MS 分析中對牛血漿樣品的磷脂去除效果和分析物回收率的差異。

用于制備磷脂去除樣品的是 Microlute® PLR 板。

Microlute® 系列采用新穎的復合技術（圖 2），該技術將捕獲磷脂的活性材料與惰性聚乙烯結構相結合。這種設計通過提高樣品流入收集板的流動一致性，改善了樣品制備的重復性，從而具有顯著優勢。

圖 2 – Microlute® 復合技術的示意圖

實 驗

血漿樣品的制備

將普魯卡因胺以三種不同濃度（25 ng/mL、250 ng/mL 和 1250 ng/mL）加入牛血漿中。溶液混勻后靜置平衡一小時。

校準曲線的制備

取 100 µL 未加標的空白血漿，加入到 Microlute® PLR板的四個孔中，隨后加入 300 µL 含 1%甲酸（v/v）的乙腈。每個孔用移液器吸取混勻五次，以確保溶液充分混合并使蛋白質沉淀。通過正壓以每秒一滴的流速將沉淀后的溶液洗脫至1.1 mL 收集板（Porvair Sciences 產品代碼：219250）中。將處理后的血漿混合液轉移至1.5 mL 微量離心管中，并渦旋混勻 10 秒鐘。取 100 µL 混合血漿加入六個孔中，制備一個空白標準和五個校準標準。五個校準標準通過添加以下濃度的普魯卡因胺溶液制備：10、100、200、500和 1,500 ng/mL。

含標血漿的處理

將 100 µL 不同濃度的加標血漿分別加入到 Microlute® PLR 板和蛋白沉淀板（Porvair Sciences 產品代碼：240100）的孔中，進行重復實驗。每種濃度做兩次重復。每孔加入 300 µL 含 1% 甲酸（v/v）的乙腈。用移液器吸取液體五次，以確保溶液充分混合并使蛋白質沉淀。隨后通過正壓以每秒一滴的流速將沉淀后的溶液洗脫至 1.1 mL 收集板中。

稀釋步驟

為改善 LC-MS/MS 方法的峰形及穩定性，將處理后的加標血漿和標準品溶液按 1:10 比例用含 0.1% 甲酸（v/v）的水中稀釋。這一稀釋步驟可防止由于洗脫液有機強度過高而導致的不良峰形問題。

圖 3 – 普魯卡因胺峰形的疊加比較 – 未稀釋（綠色曲線）與 1:10 稀釋（橙色曲線）

LC-MS/MS 方法用于柱后注入

以下方法用于篩查蛋白沉淀樣品和 Microlute® PLR 樣品中常見的磷脂[3]，并通過柱后注入法監測任何基質效應（離子增強/抑制）。注入的溶液是濃度為 100 ng/mL 的普魯卡因胺溶液，以 10 µL/min 的速率注入流動相 A 中。

HPLC 條件：

質譜儀條件

MRM 過渡

               LPC =溶血磷脂酰膽堿,   PC = 磷脂酰膽堿,  SM = 神經酰胺

用于普魯卡因胺的LC-MS/MS方法

為分析加標樣品和校準曲線，采用了以下LC-MS/MS方法：

質譜儀條件

結果與討論

磷脂去除效果

為分析通過蛋白質沉淀和復合PLR技術（Microlute® PLR）制備的血漿樣本中是否仍然存在磷脂？采用MRM LC-MS/MS方法掃描血漿中的常見磷脂，比較蛋白沉淀法和復合PLR技術（Microlute® PLR）的樣品處理效果。

磷脂去除PLR板處理的樣品在色譜圖中幾乎沒有磷脂信號，僅有基線噪音，表明樣本中所有干擾分析的磷脂已全被去除（圖4）。而蛋白沉淀樣本則顯示較大峰面積，表明磷脂仍然殘存于樣本中。

       圖 4 – 每個樣本中磷脂質MRM的重疊軌跡        A=蛋白質沉淀樣本   B = 磷脂去除板

圖 5 – 使用Microlute® PLR板和蛋白沉淀板處理樣品中的總磷脂峰面積的對比。Microlute® PLR板處理樣品的總峰面積=5.47 x 104，而蛋白沉淀板處理樣品的總峰面積=1.42 x 108

通過對磷脂色譜圖（圖4）的總峰面積進行比較，結果以柱狀圖形式呈現（圖5）。Microlute® PLR板處理的樣品中磷脂響應很低 (5.47 x 104) ，而蛋白沉淀板處理的樣品則顯示非常大的總峰面積 (1.42 x 108).

基質效應 - 離子抑制

為了量化磷脂對電離的影響，進行了普魯卡因胺的柱后注入實驗，同時注入分別采用蛋白沉淀板和Microlute® PLR板制備的空白樣品。

磷脂去除板（藍色曲線）顯示，與注入空白溶液（綠色曲線）相比，整個運行過程中離子化未受到影響。然而，蛋白沉淀樣品（黑色曲線）由于磷脂的離子抑制作用，在1.5分鐘至2.5分鐘之間的基線出現下降。如圖6所示，在磷脂共同洗脫的區域（紅色曲線），信號顯著降低。觀察到的大的信號下降約為75%，出現在普魯卡因胺的保留時間約為2分鐘。

圖6 - 普魯卡因胺注入溶劑空白樣品（綠色）、Microlute® PLR處理的樣品（藍色）以及蛋白質沉淀樣品（黑色）的注入痕跡疊加圖。同時疊加顯示了蛋白沉淀樣品的磷脂痕跡（紅色）。

普魯卡因胺標準曲線

制備基質匹配標準品，以演示使用Microlute® PLR創建的校準曲線（圖7）。標定曲線呈線性，相關系數（r2）為0.9995。本研究表明，普魯卡因胺的校準范圍為10 ng/mL至1500 ng/mL，并且呈線性關系。

圖7 – 基質匹配標準校準曲線，范圍從10 – 1500 ng/mL，r2值 = 0.9995。

普魯卡因胺的制備比較——蛋白沉淀法與PLR法

為模擬生物分析方法中使用的質量控制（QC）樣品，制備了三種不同濃度的血漿樣品- 低QC（25 µg/mL）、中QC（250 µg/mL）和高QC（1,250 µg/mL），每種濃度均進行了兩次重復，分別采用蛋白沉淀法和Microlute® PLR板進行制備。

使用LC-MS/MS對這些樣品進行分析，并通過比較峰面積來量化差異的百分比。在很低且很具挑戰性的濃度下，兩種制備方法的峰面積差異為9.6%（見表1）。這表明，兩種制備方法在從血漿中回收普魯卡因胺方面同樣有效。

           表1 – 使用三種不同濃度水平的血漿制備普魯卡因胺的峰面積（每種濃度進行兩次重復）。兩種技術在各濃度下的峰面積百分比差異。

結 論

本研究簡要展示了在生物樣品的色譜分析前進行樣品制備的必要性。樣品制備可以避免離子抑制，從而提高信號強度和靈敏度，同時減少儀器維護需求。此外，通過比較兩種技術（蛋白沉淀法和PLR法），結果表明磷脂去除活性成分并未影響分析物的回收率。這說明Microlute® PLR板具有更優異的性能，不僅保持了高回收率，同時減少離子抑制，從而提供更可靠和穩健的分析結果。

參考文獻：

1: O. A. Ismaiel, M. S. Halquist, M. Y. Elmamly, A. Shalaby and H. T. Karnes, “Monitoring phospholipidsfor assessment ofion enhancement and ionsuppression in ESI andAPCI LC/MS/MSfor

chlorpheniramine in human plasma andthe importance of multiplesource matrix effect evaluations,"Journal ofChromatography B,vol. 875, no. 2, pp. 333-343, 2008.

2:J. CarmicalandS. Brown, “The impact of phospholipidsand phospholipid removal on bioanalyticalmethod performance," Biomedical Chromatography,vol. 30, no. 5, pp. 710-720, 2016.

3: G. B. PhillipsandJ.T. Dodge, “Composition of phospholipids and of phospholipidfattyacids ofhuman plasma,"Journal of Lipid Research,vol. 8, no. 6, pp. 676-681, 1967.